Обращённо-фазная хроматография

Обращённо-фазовая (обратно-фазовая) хроматография (ОФХ) — вариант хроматографии, в котором стационарная фаза является неполярной. Этот вариант хроматографии относится к жидкостной хроматографии (в отличие от газовой).

Термин «обращённо-фазовая» имеет под собой историческую подоплёку. В 1970-х годах для жидкостной хроматографии в большинстве случаев использовалась твёрдая стационарная фаза (также называемая «колонка»), которая содержала немодифицированные кремниевые или алюминиевые наполнители. Сегодня этот метод известен как «нормально-фазовая хроматография». В случае нормально-фазовой хроматографии стационарная фаза гидрофильна (обладает большим сродством к гидрофильным молекулам в подвижной фазе). Поэтому гидрофильные молекулы в подвижной фазе имеют тенденцию связываться (адсорбироваться) на колонке, в то время как гидрофобные молекулы проходят сквозь колонку и элюируются в первую очередь. В нормально-фазовой хроматографии гидрофильные молекулы могут быть элюированы с колонки путём увеличения полярности раствора подвижной фазы.

Появление методов, использовавших алкильные цепи, ковалентно связанные с твёрдой основой, позволили создать гидрофобную неподвижную фазу, имеющую сильное сродство к гидрофобным соединениям. Использование гидрофобной неподвижной фазы может рассматриваться как противоположность или «обратное» по отношению к нормально-фазовой хроматографии — отсюда и произошёл термин «обратно-фазовая хроматография». Обратно-фазовая хроматография использует полярную (водную) подвижную фазу. В результате, гидрофобные молекулы в полярной мобильной фазе адсорбируются на гидрофобной неподвижной фазе, а гидрофильные молекулы в мобильной фазе будут проходить через колонку и элюироваться в первую очередь. Гидрофобные молекулы могут быть элюированы с колонки путём уменьшения полярности мобильной фазы, используя органические (неполярные) растворители, которые снижают гидрофобные взаимодействия. Чем более молекула гидрофобна, тем сильнее она свяжется с неподвижной фазой и тем выше концентрация органического растворителя, которая потребуется для элюирования этой молекулы.

Многие математические и экспериментальные предположения, используемые в других хроматографических методах, также применимы в ОФХ (например, "разрешение разделения" зависит от длины колонки). Она также может использоваться для разделения большого количества видов молекул. Этот метод обычно не используется для разделения белков, потому что используемые органические растворители могут денатурировать большинство белков. Поэтому, в данном случае нормально-фазная хроматография является более приемлемым методом.

Сегодня ОФХ часто используется в аналитических целях. Существует целый ряд различных неподвижных фаз для ОФХ, что позволяет быть более гибким в выборе методов разделения.

Стационарная (неподвижная) фаза

Таблица 1. Основные стационарные фазы, применяемые в обращённо-фазовой ВЭЖХ.

Обозначение	Описание	Структура
C1, TMS, SAS, триметил	Обладает высокой селективностью при разделении полярных соединений и соединений с большим количеством функциональных групп.Меньше всего удерживает соединения с алкильными группами в неполярных растворителях.	Метил
C2, RP-2, диметил	Обладает большим удерживанием, чем С1, и меньшим, чем С4, С8 и С18.	Этил
С3, Пропил	Применяется в хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) пептидов и белков.	Пропил
С4, Бутил	Применяется для HIC и ион-парной хроматографии. В неполярных растворителях обладает меньшим удерживанием, чем фазы С8 и С18. Данный материал с диаметром пор 300Å идеален для анализа больших белков и гидрофобных пептидов.	Бутил
С5, Пентил	С диаметром пор 300Å используется для обращённо-фазового разделения гидрофобных белков и пептидов. Более устойчив к гидролизу, чем С4.	Пентил
С6, Гексил	Применяется для ион-парной хроматографии. Обладает меньшим удерживанием, чем С8 и С18.	Гексил
С8, MOS, RP-8, LC8, Октил	По селективности близок к С18, но обладает меньшим удерживанием. Широко используется в анализе лекарств, нуклеотидов, стероидов и т.д. С диаметром пор 300Å этот материал хорошо подходит для разделения пептидов и небольших гидрофильных белков.	Октил
С12, Додецил	Благодаря более короткой углеродной цепи, чем у С18, обеспечивает хорошее взаимодействие и более чёткую форму пиков для неполярных и умеренно полярных соединений.	Додецил
С18, ODS, RP-18, LC-18, Октадецил	Классический обращённо-фазовый материал, обладающий наибольшим удерживанием в неполярных растворителях. Прекрасно работает в ион-парной хроматографии. Имеет широчайший спектр применений (разделение пептидов, нуклеозидов, нуклеотидов,стероидов, фармпрепаратов, витаминов, жирных кислот, пестицидов и пр.). С диаметром пор 300Å этот материал используют для разде